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体外抗体形成细胞检测——液相小室法

作者:澳门赌场下载发布时间:2017-10-12 17:37浏览:

1、基本原理

溶血空斑试验,又称空斑形成细胞(Plague Forming Cell, PFC)试验,是一种体外检测抗体形成细胞的方法。将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔,四天后将小鼠杀死,取脾脏制成脾细胞悬液,内含抗体形成细胞。然后将脾细胞、绵羊红细胞,补体混合孵育。由于PFC所分泌的抗体和绵羊红血球结合形成抗原抗体复合物,在补体作用下可使红细胞溶解,于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。一个空斑即代表一个抗体形成细胞。

2、实验材料

(1)解剖器械、试管、1ml吸量管;

(2)载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器;

(3)ICR小鼠(北京大学医学部实验动物中心提供);

(4)5%和10%绵羊红血球(SRBC);

(5)补体(豚鼠血清,经SRBC吸收,临用时稀释成合适浓度)。

3、实验方法

(1)小鼠免疫及脾细胞悬液的制备 将5%SRBC (0.4ml)注射于小鼠腹腔,4天后拉脱颈椎处死,取出脾脏放在已加入6ml Hank’s液的平皿中。在100目不锈钢网上研磨,过滤混匀,从中吸取lml加入试管中,加满Hank’s液混匀,离心1000rpm,10分钟。将沉淀的脾细胞恢复lml容积,即为约107/ml浓度的细胞悬液。

(2)制作小室 取无脂载玻片(75mm×25mm), 平置桌面上。用双面胶带在载玻片两端和中间各粘一条,然后再覆盖上同样的载玻片,即形成两个小室。将此双层玻片的一侧长边浸入融化的石腊池中以封闭小室的一边(无需浸入过深,以能封闭小室边缘为准)。

(3)小室灌注细胞悬液 取107/ml脾细胞悬液100ml,10%SRBC 200ml,补体 200ml,Hank’s液 1m1混匀后,用尖吸管灌注小室、蜡封、标记、平放于玻片盘内,置37℃孵箱30—45分钟。

4、实验结果

观察小室内的透明空斑,一个空斑即代表一个空斑形成细胞(PFC),即B细胞。

5、注意事项

(1)小室注入液体时不要留有气泡;

(2)小室边缘需用石蜡封严;

(3)37℃孵箱孵育时,必须放平,不可倾斜;

(4)观察结果时,应注意辨别空斑与气泡的区别,避免将气泡误认为溶血空斑。