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绿色荧光蛋白(GFP)标记亚细胞定位

作者:澳门赌场下载发布时间:2017-10-16 09:50浏览:

一、原理

利用绿色荧光蛋白(GFP)来示踪胞内蛋白的技术。利用GFP融合蛋白技术来进行活细胞定位研究是目前较为通行的一种方法,在光镜水平进行研究,不需要制样,没有非特异性标记的影响。并且GFP的分子量为27kD,经激光扫描共聚集显微镜激光照射后,可产生一种绿色荧光,从而对蛋白质进行精确定位。

激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM, 以下简称共聚焦显微镜)因其独特的设计原理,有效地排除了非焦平面信息,提高了分辨率及对比度,使图像更为精确清晰,因此极其适于进行活细胞内蛋白质、核酸等定位及活体动态研究。

二、主要步骤

1.真核表达载体的构建

①引物设计

利用引物设计软件,根据pEGFP-N1的酶切位点设计目的基因引物:

②载体构建

将PCR产物酶切后插入pEGFP-N1,得到表达目的基因与EGFP融合蛋白质的真核表达载体。

2.转染真核细胞

当细胞生长到对数生长期时,接种到共聚焦显微镜专用的玻璃底培养皿(35mm petri dish,10 mm Microwell)中,培养过夜。当细胞贴壁率达到30%~50%时,将表达载体质粒2ug和脂质体(Lipofectamine2000) 2ml分别溶于100 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基中,充分混匀后,室温放置15 min,再将两种溶液充分混匀,室温放置30 min。同时用无血清、无抗生素的DMEM洗涤待转染的培养细胞2~3次,向DNA-脂质体混合物中加入800 ml无抗生素、无血清的DMEM培养基,混合后加入到培养细胞中。培养皿放入37℃孵箱孵育6~8 hr后吸去双无培养液,加入2~3 ml含抗生素和10% FCS的DMEM完全培养基,继续培养24~72 hr。

4.激光扫描共聚焦显微镜观察

将上述细胞分别在24、、36、48、72小时用共焦显微镜观察,采用激光扫描共聚焦显微镜,激发波长为488nm,采取图像。