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包涵体(inclusion body)表达的蛋白的复性-2

作者:澳门赌场下载发布时间:2017-10-16 09:46浏览:

还原剂:
由于蛋白间二硫键的存在,在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mM2-BME或DTT,也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下,可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关,而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响,如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶,有时还原剂的使用也是必要的,可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

复性:
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到2M左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从4M开始,到1.5M 时复性过程已经结束。

复性中常采用的方法有:
稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。
透析复性:好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成沉淀,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。
超滤复性:在生产中较多的使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性:是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法,如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。

还原剂的去除:
还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除,使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的,可以考虑在变性剂完全去除之后,在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有:
空气氧化法:在碱性条件下通空气,或者加入二价铜离子,能够取得更好的效果,缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对(redox):常采用GSSG/GSH,通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势,也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如:5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

复性的效率:
复性是一个非常复杂的过程,除与蛋白质复性的过程控制相关外,还很大程度上与蛋白质本身的性质有关,有些蛋白非常容易复性,如牛胰RNA酶有12对二硫键,在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上,而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11,很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来,蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度,变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。

复性过程的添加剂:
1、共溶剂:如PEG6000-20000,据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团,此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会,也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右,具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶(PDI)和脯氨酸异构酶(PPI):PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合,从而有利于恢复到正常的结构,此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量,常常是复性过程中的限速步骤,而PPI的作用是促进两种构象间的转变,从而促进复性的进行。
3、分子伴侣,即热休克蛋白(HSP),是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子,研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株,据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg:成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中,可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等:增加黏度,减少分子碰撞机会,一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度,可能是为了降低某些带电集团间的斥力,有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子:添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法:通过将目标蛋白结合到层析柱上,减少蛋白分子间的相互影响,该方法得到越来越多的应用,常用的色谱有SEC、HIC、IEC、 IMAC等。
当然,虽然有很多所谓的理性的复性方案设计,目前的复性工作更多的是一个经验的过程,没有一种通用的方法可以套用。

复性时的蛋白浓度:
一般使用浓度为 0.1-1mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。

复性效果的检测:
根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质,或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法:如IEX、 RP-HPLC、CE等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好的反映了复性蛋白的活性,值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法:如ELISA、WESTERN等,特别是对结构决定簇的抗体检验,比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

几个复性的实例:
1、MHCII JBC 269(47):1994
增溶:16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
复性:8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶:10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
复性:10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr,开口透析8hr,对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、 Bovine Prethrombin-2,JBC 270(1):1990 四对二硫键。
增溶:7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性:稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次,温度4度。

纯化:
一般说来,复性液的体积较大,为了减少处理体积,在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀,沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高,可以直接进行HIC纯化,目标峰经适当稀释后(cond<5mS/cm)进行IEX纯化,然后通过SEC脱盐,更换缓冲液,除菌过滤后,在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下,也可以直接将复性液进行IEX纯化,优点是在纯化的同时进行体积的浓缩,为以后的精制创造条件。
从生产的角度看,由于每增加一步纯化工序便降低很多收率,所以可过两到三次柱纯化,工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则,对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白,不得不进行多次纯化。