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包涵体(inclusion body)表达的蛋白的复性-1

作者:澳门赌场下载发布时间:2017-10-16 09:45浏览:

蛋白的复性是一个世界性的难题,没有通用的方法,甚至没有靠得住的规律,只能试。

可以参考以下文章。该文出处已经忘了,如果有人知道原创作者或网上出处,请补充。

包涵体表达的蛋白的复性

包涵体:
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集,形成无活性的固体颗粒。

包涵体的组成与特性:
一般含有50%以上的重组蛋白,其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等,环状或缺口的质粒DNA,以及脂体、脂多糖等,大小为0.5-1um,难溶与水,只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

包涵体的形成:
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子,或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。
1、表达量过高,研究发现在低表达时很少形成包涵体,表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体,而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类,致使中间体大量积累,容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

包涵体表达的有利因素:
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击,包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。
2、降低了胞内外源蛋白的浓度,有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低,且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离,有利于分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感,易于破壁,并与细胞膜碎片分离。

破菌:
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎

分离:
1、离心:5000-20000g15min离心,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。
2、过滤或萃取方法:

洗涤:
由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起,在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体,通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mM TrispH7.0-8.5左右,1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。

溶解:
常用的变性剂有尿素(8M)、盐酸胍(GdnHCl6-8M),通过离子间的相互作用,破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差,异氰硫酸胍(GdnSCN)最强。

去垢剂:如强的阴离子去垢剂SDS,可以破坏蛋白内的疏水键,可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。

极端pH:可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间:一般在偏碱性性的环境中如 pH8.0-9.0,尿素在碱性环境中不稳定,一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜,但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。